液相色谱分析法

返回应用

色谱分析法是分析化学中最强大的工具之一，也是实验室中最常见的方法之一。 在这项技术中，流动相是液体。

高压液相色谱法（现被称为高效液相色谱法，HPLC）是一项色谱技术，用于识别、量化、分离和纯化混合物中存在的单个化合物[1]。

采用高效液相色谱法 (HPLC) 时，让样品混合物与液体溶剂在高压下一起通过填充有固体吸附材料的纯化柱。 借助泵，累积系统内的压力。 工作原理是，混合物中的每种化合物与纯化柱中的吸附材料相互作用略有不同，从而导致不同成分具有不同流速。 这导致各成分从纯化柱流出时会分离。 所使用的吸附材料通常为颗粒状，由构成“固定相”的固体粒子（诸如二氧化硅）组成。 加压液体是溶剂混合物，如水和有机液体（如甲醇和乙腈），此类液体构成“流动相”。

检测器连接至数字微处理器和用于数据采集和分析的用户软件。 分离的化合物可视化为“峰”，峰的数量与混合物中分离的成分的数量相对应。 峰面积与混合物中的化合物浓度成正比[2]。 色谱技术的两个峰之间的分辨率是实验期间物质分离的程度。 高分辨率表示化合物分离良好。

高效液相色谱法在生物化学、分析化学、药品、法医学、食品研究等领域具有广泛的应用。 例如， 运动员禁用物质的检测中也会用到 HPLC。

HPLC 既经济实惠，又具备适用能力。 它拥有数据管理和仪器验证等实用优势。

超高效液相色谱 (UHPLC) 是 HPLC 的一种变体，它使用较小的粒子来提高色谱性能，并且需要较高的压力。 与 HPLC 类似，水污染物可能对结果产生负面影响。然而，由于 UHPLC 的灵敏度较高，结果可能会更为极端。

HPLC 和 UHPLC 均可用于液相色谱分析法，但两者运行所需的设备并不相同，各有不同的优势。 较短的柱长意味着超高效液相色谱法比传统 HPLC 的分辨率更佳。

离子色谱法可基于离子和极性分子与离子交换介质柱的相互作用来分离。 该方法几乎可用于任何一种带电分子，包括大蛋白、小核苷酸和氨基酸。 它被广泛用于测定无机和有机阳离子和阴离子。

试剂水的水质几乎可以影响 HPLC 分析的各个方面，从样品和标准制备到柱冲洗和洗脱均有影响。 这也使水成为 HPLC 过程中消耗量最大的试剂。

通常将 2 级纯水用于空白制备、标准液、洗脱剂和样品预处理；然而，由于梯度 HPLC 的检测限值极低，用水要求更为严格，需要最高的水质。

很大一部分 HPLC 性能问题由 HPLC 洗脱液、标准液和样品的制备过程中所用水的水质较差而导致。 水质差或受污染的水通过在色谱分离期间引入鬼峰、改变固定相选择性、影响基线来影响分辨率。

此外，它还可导致污染物在固定相中积聚，从而导致柱体堵塞。 这会导致压力增加，样品运行时间发生变化。 数据质量欠佳，例如保留时间变化、分辨能力降低或出现鬼峰，可能表明有机物、离子、细菌或粒子物已造成了污染。

1. 有机物

超纯水中的有机污染物可以以不同方式影响色谱分离：

(i) 缩短纯化柱寿命  - 吸附在柱表面的有机分子可以减缓样品和溶剂分子进入纯化柱多孔珠内的吸附点（固定相）。 这会造成纯化柱分离化合物的能力降低或者分辨能力降低，缩短纯化柱寿命。

(ii) 降低灵敏度  - 洗脱水中的有机分子会与样品分子竞争吸附到纯化柱多孔珠上（固定相）。 这样会减少吸附于纯化柱上的样品分子数量，结果导致洗脱过程中所释放的分子数量减少。

(iii) 数据不准确  - 有机物可在纯化柱顶部积聚，之后以洗脱液形式聚集，此类有机物可能会产生污染物或鬼峰。

(iv) 保留时间变化  - 高浓度有机物可在纯化柱中形成新固定相，可导致保留时间变化和拖尾峰出现。 也可导致回压增加。

因此，准确监测用于 HPLC 应用的水的有机物浓度很关键。 总有机碳量 (TOC) 是衡量水中总有机物量的指标。 TOC 以百万分之一（ppm）或十亿分之一（ppb) 计。 以高 ppb 存在的有机物可改变混合物中微量成分的光谱识别并影响峰定量。

HPLC 系统可能受到各种 TOC 污染源的影响。 包括水、纯化介质中的渗出物、管道、容器、细菌污染物以及潜在的空气吸入。 事实上，现在建议避免使用未经新鲜纯化的高纯度瓶装水。 这是因为在实验室环境下放置超过 8 小时（接触大气有机物）的 HPLC 瓶装水或蒸馏水容易受到 TOC 水平上升的影响。

图 1 比较了在 254 纳米和 214 纳米波长下测量的 HPLC 级水和超纯水的色谱输出。 相较于超纯水[2]，HPLC 级水的 TOC 水平更高，该水从纯化柱洗脱出来，可导致基线变化，峰大小和数量增加。

因此，使用纯水进行 HPLC 分析至关重要，并且保持水不含各种污染物也非常重要。 色谱仪除了确保有机溶剂、标准液和其他 HPLC 流动相成分的纯度外，还必须确保试剂水水质良好，没有任何污染物。

2. 粒子和胶质

若水样本中存在粒子和胶质，除了物理上堵塞柱子外，还会对泵和注射器造成损害。 这些也可以在结合有样品成分的纯化柱内作为固相。 胶质还可以不可逆地吸附至纯化柱材料上，以此防止样品成分与纯化柱结合。

3. 离子

溶剂中有离子存在也可影响色谱分离。 任何紫外线吸收的离子，例如硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、溴化物、氯化物和氟化物，都可以穿过纯化柱并在色谱图中形成峰，从而使数据难以分析。

在影响 HPLC 分析的不同水污染物中，目前为止，有机物是水纯度的最重要决定因素。 实验证据充分表明，新鲜制备的超纯水应该是 HPLC 的适用之选，因为其他水源，即蒸馏水或甚至 HPLC 级瓶装水仍然含有相对较多的有机物，这可能会损害色谱图的质量和仪器的性能（见图1 ）。

因此，必须确保使用高标准水纯化系统，并妥善维护系统本身。

确保您针对特定应用使用了恰当类型的水。 液相色谱法应用的相关要求如下：

> 5

18.2

< 50

< 10

< 0.2

< 0.2

< 10

< 1

NA

NA

NA

NA

一般 实验室

超纯

>1

> 18

< 50

< 3

< 0.2

< 0.2

< 1

< 1

NA

NA

NA

NA

一般 实验室

超纯

目前存在多种不同的纯化系统，每种方法都有其自己的优势和局限性。 ELGA 在水纯化系统的专业度久负盛名。 ELGA 将水的纯度分为不同等级，这有助于确定给定应用所需的水纯度水平。 例如，我们的PURELAB® Chorus 1 分析研究系统可提供 TOC 水平低至 2 ppb 的 1 级超纯水，这非常适用于 HPLC 实验。 ELGA 提供用户友好、经济划算和低维护的水纯化系统。

总结

水作为实验室试剂，其纯度是实验成功与否的关键。 高度敏感的技术，如 HPLC 需要纯度非常高的水，这意味着所使用的水应具有最低的 TOC 水平，并且不含任何其他污染物。 新鲜制备的超纯水是 HPLC 实验的适用之选， ELGA 各系列水纯化系统有助于全球研究人员确保其实验中使用的水具有所需的纯度。

[1] Jena A Kumar. HPLC: Highly Accessible Instrument in Pharmaceutical Industry for Effective Method Development. Pharm Anal Acta 2012;3. doi:10.4172/2153-2435.1000147.

[2] Malviya R, Bansal V, Prakash Pal O, Kumar Sharma P. High performance liquid chromatography: A short review. J Glob Pharma Technol 2010;2:22–6.

ELGA LabWater 实验室超纯水纯化系统包括 PURELAB、MEDICA、 CENTRA 系列，这些系列均采用 PURESURE 水过滤技术